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蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑各自作用特點
點擊次數(shù):1060 更新時間:2023-07-24

1、蛋白酶抑制劑
     破碎細胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶,這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中,需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)從廣義上指與蛋白酶分子活性中心上的一些基團結(jié)合,使蛋白酶活力下降,甚至消失,但不使酶蛋白變性的物質(zhì)。各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同,因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低,尤其應(yīng)注意在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑時應(yīng)充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。

常用的蛋白酶抑制劑和各自作用特點如下:

(1) 苯甲酰磺酰氟(PMSF):抑制絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶,凝血酶)和巰基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);

(2) 乙二胺四乙酸(EDTA):作為螯合劑可逆抑制金屬蛋白水解酶;

(3) 胃蛋白酶抑制劑(pepstantin):抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶,血管緊張肽原酶,組織蛋白酶D和凝乳酶;

(4) 亮抑蛋白酶肽(leupeptin):可逆抑制絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶,如木瓜蛋白酶,血漿酶和組織蛋白酶B;

(5) 胰蛋白酶抑制劑(aprotinin):競爭性可逆抑制絲氨酸蛋白酶,如血漿酶,血管舒緩素,胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;

(6) AEBSF:一種水溶性的絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑,其抑制常數(shù)與PMSF和DFP的抑制常數(shù)相似,可以有效抑制胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶(chymotrypsin)、纖溶酶(plasmin)、激肽釋放酶(kallikrein)和凝血酶(thrombin)等蛋白酶,作為PMSF和DFP的替代物,AEBSF的毒性更低、水溶性和水溶液穩(wěn)定性更好。

(7) 烏苯美司(I Ubenimex,NN,也稱為bestatin):競爭性,可逆的氨基肽酶抑制劑,對精氨酰氨基肽酶(氨基肽酶B),白三烯A4水解酶(顯示環(huán)氧化物水解酶和氨基肽酶活性的鋅金屬蛋白酶),丙氨酰氨基肽酶(氨肽酶M /N),亮氨酰/胱氨酰氨基肽酶(催產(chǎn)素/血管加壓素酶)(白三烯D4水解酶)有抑制作用;

(8) N-(反式-環(huán)氧丁二?;?L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E64):半胱氨酸蛋白酶不可逆抑制劑;

(9) 胃酶抑素A(Pepstatin A):天冬氨酸蛋白酶可逆抑制劑。

2、磷酸酶抑制劑

     細胞或組織裂解時會釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶,以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化,從而影響后續(xù)的蛋白檢測。因此在提取物中適量添加外源性磷酸酶抑制劑,有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質(zhì)和蛋白激酶活性測定等實驗過程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化,維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。

常見的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶,常用的磷酸酶抑制劑如下:

(1) 氟化鈉(sodiμm fluoride):酸性磷酸酶可逆抑制劑;

(2) 焦磷酸鈉(sodiμm pyrophosphate):絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑;

(3) β-甘油磷酸(β-glycerophosphate):絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑;

(4) 正釩酸鈉(sodiμm orthovanadate):堿性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制劑:

(5) 鉬酸鈉(sodiμm molybdate):酸性磷酸酶不可逆抑制劑;

(6) 二水酒石酸鈉(sodiμm tartrate dihydrate):酸性磷酸酶可逆抑制劑;

(7) 咪唑(imidazole):堿性磷酸酶可逆抑制劑。

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